Fluo-4是一種將Fluo-3結構中的Cl替換成F的鈣熒光探針。由于將Cl替換成了電子吸引力更強的F，它的最大激發波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長，所以用氬激光器激發時，Fluo-4的熒光強度比Fluo-3強一倍。

Fluo-4, AM穿透細胞膜進入細胞后被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-4，從而被滯留在細胞內，Fluo-4若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，最大激發波長為494nm，最大發射波長為516nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。

操作說明（for Human T cells）*

（1） 試劑

2 mM的Fluo-4, AM/DMSO（將1mg Fluo-4, AM溶于442μL DMSO）

Pluronic F127

Hanks•balanced salt solution（HBSS）

HEPES buffer saline（10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4）

（2） 操作

①. 向Fluo-4, AM/DMSO溶液中加入16.5mg Pluronic F127，Pluronic F127可以    防止Fluo-4, AM在HBSS中聚合并能幫助其進入細胞。

②. 用HBSS稀釋Fluo-4, AM溶液，制備4μM的Fluo-4, AM工作液。

③. 將Fluo-4, AM工作液加入細胞，在37℃培養20分鐘。

④. 加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS，再繼續培養40分鐘。

⑤. 用HEPES buffer saline洗滌細胞3次，然后用HEPES buffer saline使細胞重懸浮，制成1×105 cells/mL的溶液。

⑥. 37℃下培養10分鐘，然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測。激發波長494nm，發射波長516nm。  

*標記的條件因細胞種類而異，在每次實驗前，請先確定最佳條件。以上方法僅供參考。

儲存條件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。